当前位置: 永盛彩票网  >> 医学专业  >> 中医学  >> 查看详情

中医学----不同种质和表型当归与习用品东当归、牡丹叶当归的rDNA ITS序列解析

来源: 长沙中视澜庭教育咨询有限公司  日期:2018-02-25 08:56:57  点击:78 
分享:
您若需要更全面指导,咨询请加QQ:157677920(张老师)2593328532(李老师),微信(电话同号):17051272921。
当归为常用中药,始载于《神农本草经》,列为中品。来源为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根。有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效。目前主要分布在甘肃、云南、四川、湖北、陕西等地。当归的野生资源由于过度采挖已经濒临枯竭。笔者通过当归的种质资源调查,发现当归有紫茎和绿茎之分。另外,四川等地栽种有东当归Angelicaacutiloba (Sieb.et Zucc.) Kitagawa,东当归又称日本当归,在日本作为当归入药。在西藏林芝等地,还有野生的牡丹叶当归(Angelica paeoniifolia Shan et Yuan),在西藏林芝等地也多将牡丹叶当归的根作为当归入药。

  随着分子生物学技术的发展,出现了一些新的中药鉴别方法。PCR直接测序法是20世纪90年代迅速发展起来的测序技术,具有快速、灵敏、准确率高等特点。其中核糖体DNA中的内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列的进化速率较快,可用于解决属下不同种和种内的系统发育和分类问题。近几年,该技术在中药材的鉴别中得到一定的应用。本研究通过对14个不同种质和表型的当归及其地方习惯用品东当归、牡丹叶当归的ITS序列进行测序和分析,探讨该片段在中药当归分子生物学水平上的鉴定意义。
  1 材料与方法
  1.1 材料
  ITS测序序列样品来自14个当归和习用品牡丹叶当归和东当归的新鲜嫩叶。
  1.2 DNA提取
  新鲜植物叶片,参照Rodrigues组织培养表面消毒的方法处理后各0.1 g,加液氮研磨成细粉后,使用改良的CTAB 法提取总DNA,于-20 ℃保存备用。
  1.3 PCR扩增和产物纯化
  PCR扩增引物为真核ITS扩增专用产物LH2、ITS4。引物均由上海生工生物工程有限公司合成,序列为LH2:5′-GTCGAATTCGTA GGTGAACCTGCG-GAAGGATCA-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反应液(以20 μL/L 反应体积为例):10×PCR buffer 2 μL,10 mmol·L-1 dNTP 0.5 μL,Mg2+(25 mmol·L-1)2.4 μL,引物LH2和ITS4(10 μmol·L-1)各1 μL,Taq 酶(5 U·μL-1)0.1 μL,DNA模板(适宜浓度)2 μL,灭菌三蒸水(3dH2O)10 μL。PCR 扩增条件为94 ℃变性4 min,94 ℃ 1 min,50 ℃ 2 min,72 ℃ 1 min,循环30次;72 ℃延伸10 min,以灭菌三蒸水代替模板DNA 作空白对照。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。用QIAGENPCR产物纯化试剂盒进行PCR产物的纯化。
  1.4 PCR产物ITS序列的测定
  纯化后的PCR产物作为测序反应的模板,PCR反应的引物直接作为测序引物,采用双脱氧终止法终端荧光标记,进行DNA序列的正向和反向测定。测序反应在ABI 377测序仪上进行。所得序列用CLUSTAL X(Version 1.8)进行多重比对,编辑和校正多重比对结果用BioEdit;ITS1和ITS2的位置参照其二级结构和EMBL和Gen-Bank上的参考序列。
  2 结果
  根据GenBank中的当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的ITS序列(Genebank:GU289663.1)确定当归和东当归、牡丹叶当归的rDNA内转录间隔区ITS1和ITS2与3个编码区18S、5.8S、26S的界限。测得当归14个个体的ITS-1,5.8S rDNA和ITS-2全序列及18S rRNA基因3′端和26S rRNA 基因5′端部分碱基序列,共约664bp。其中ITS1序列长度215bp, 5.8S长162bp,ITS2序列长度为223bp。习用品东当归长663bp,其中ITS1序列长度216bp,5.8S长162bp,ITS2序列长度为221bp。习用品牡丹叶当归长664bp,其中ITS1序列长度215bp,5.8S长162bp,ITS2序列长度为223bp。当归ITS1的G+C%含量在54.42%,ITS2的G+C% 含量在55.16%。ITS序列测序结果表明,14个不同种质的当归其ITS序列都全部一致,包括两种表型即紫茎当归和绿茎当归、野生当归和栽培当归。
  将当归、东当归和牡丹叶当归ITS序列比对,计算其遗传距离。当归与东当归的遗传距离为8.6,与牡丹叶当归的遗传距离为9.6,而东当归与牡丹叶当归的遗传距离为10.7。
  3 讨论
  当归的植物表型可以分为紫茎当归和绿茎当归,其中绿茎当归其茎秆、叶、叶鞘等均为绿色,明显区别于紫茎当归,但是从ITS序列结果来看,绿茎当归和紫茎当归ITS序列并无区别,栽培和野生的ITS序列也完全相同。尽管有很多报道发现ITS序列存在种内多态性,即不同亚种、居群的同一位点有2或2个以上的核苷酸类型[5-6]。但还是有国外很多报道指出有些物种ITS位点内(intralocus)、位点间(interlocus)的同步进化,导致没有位点多态性[7-8]。国内有人研究发现胀果甘草和黄甘草、光果甘草和蜜腺甘草的ITS序列完全相同。不同种质和表型的当归其ITS序列没有变异,可能与其ITS位点内和位点间的同步进化有关。不同种质和表型的当归有非常相近的遗传背景,它们之间的形态学差异可能是长期栽培过程中自然进化和人工选择的双重因素造成的结果。
  当归与习用品东当归和牡丹叶当归的遗传距离表明,当归与东当归有更相近的遗传基础,而这两者在化学成分上也有很多相同或相近的成分,如均含挥发油、藁本内酯、多糖等成分。目前对牡丹叶当归的化学成分研究较少,建议对其进一步研究,明确其药用成分和药效,为其开发利用奠定基础。ITS序列作为分子标记构建系统树和分析亲缘关系不具普遍适用性。用ITS序列来对不同种质和表型的当归进行遗传多样性分析并不适宜。但高度保守的ITS用来鉴定当归的真伪是非常合适的,当归与习用品东当归和牡丹叶当归可以用ITS序列来进行鉴别。
 

相关新闻

    暂无信息