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中医学----谈十三味马钱子丸中士的宁和马钱子碱的HPLC 测定

来源: 长沙中视澜庭教育咨询有限公司  日期:2018-02-25 08:56:57  点击:79 
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十三味马钱子丸由马钱子、藏木香、宽筋藤、悬钩木、干姜、诃子、沉香、肉豆蔻、木香、广枣、安息香、绿绒蒿、藏茜草十三味中藏药组成,收载于《卫生部药品标准》藏药第一册。其主要成分为毒性药材马钱子,因马钱子治疗剂量与中毒剂量较接近,应对马钱子中的主要毒性成分士的宁和马钱子碱的含量进行检测。采用HPLC 对含马钱子制剂中士的宁和马钱子碱含量测定研究有较多文献报道,但目前尚无十三味马钱子丸制剂中士的宁和马钱子碱含量测定的研究文献。本实验研究建立了HPLC 测定十三味马钱子丸中士的宁和马钱子碱的测定方法,可做为修订该制剂质量标准的参考依据。

  1 仪器与试药
  LC-2010A 高效液相色谱仪(日本岛津),士的宁对照品(批号:110705-200306)、马钱子碱对照品(批号:110706-200505)均由中国药品生物制品鉴定所提供。十三味马钱子丸(青海通天河藏药制药有限公司提供,批号:20090401;西藏金珠雅砻藏药有限责任公司提供,批号:110101、110102 、110103)。乙腈为色谱纯,水为重蒸馏水,其余为分析纯。
  2 方法与结果
  2.1 色谱条件
  色谱柱为DikmaC18(4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈-0.01mol/L 庚烷磺酸钠与0.02mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液( 用10% 磷酸调节pH 值2.8)(10∶90)为流动相,峰形及保留时间均比较理想;检测波长:260 nm;柱温:30℃;流速:1 mL/min;进样量:10 μL。
  2.2 溶液制备
  2.2.1 对照品溶液的制备
  精密称取士的宁对照品约6 mg,置10 mL 量瓶中,加三氯甲烷适量使溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取2mL,置10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得( 实际含量为每1 mL 中含士的宁0.131 mg)。精密称取马钱子碱对照品约5 mg,置10 mL 量瓶中,加三氯甲烷适量使溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取2 mL,置10 mL 量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得(实际含量为每1 mL 中马钱子碱0.086 mg)。
  2.2.2 供试品溶液的制备
  取本品适量,研细,取约3g,精密称定,加15 mL氢氧化钠试液,混匀,放置1 小时,精密加三氯甲烷25 mL,称定质量,超声处理(功率120 W,频率40 kHz)30 分钟,放冷,再称定质量,用三氯甲烷补足减失的质量,置分液漏斗中,分取三氯甲烷层,用铺有少量无水硫酸钠的滤纸滤过,精取10 mL 三氯甲烷液,置25 mL 量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,即得。
  2.2.3 阴性样品溶液的制备
  按处方比例及制备工艺,配制不含马钱子的阴性对照样品,并按上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
  2.3 专属性实验
  取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液,分别按上述色谱条件进行测定,样品与对照品在同一保留时间有相同的波峰出现,而空白溶液则无相应的波峰。样品、对照品、阴性对照高效液相色谱图。
  2.4 线性关系考察
  精密吸取上述士的宁对照品溶液(0.131mg/mL)2、4、6、8、10 μL,按上述色谱条件分别注入液相色谱仪,以对照品的进样量为横坐标,相应的峰面积积分值为纵坐标,计算回归方程:C=5.393 69×10-7A+2.570 23×10-3,r=0.999 8,士的宁在0.262~1.310 μg 内有良好的线性关系。精密吸取上述马钱子碱对照品溶液(0.086 mg/mL)2、4、6、8、10 μL,按上述色谱条件分别注入液相色谱仪,以对照品的进样量为横坐标,相应的峰面积积分值为纵坐标,计算回归方程:C=7.347 71×10-7A-0.0113 5,r=0.999 5,马钱子碱在0.172~0.860 μg 内有良好的线性关系。
  2.5 精密度实验
  分别精密吸取士的宁对照品溶液与马钱子碱对照品溶液各10 μL,按上述色谱条件测定,各进样6 次,测定峰面积积分值,士的宁对照品溶液RSD 为2.11%,马钱子碱对照品溶液RSD 为2.80%。
  2.6 稳定性实验
  取同一供试品溶液,分别在0、2、4、6、8 小时,按上述色谱条件各进样一次,每次10 μL,结果士的宁、马钱子碱在8 小时内稳定。RSD 分别为1.03%、2.90%。
  2.7 重复性实验
  精取同一批供试品6 份,按上述供试品溶液制备方法和色谱条件重复试验测定,士的宁平均含量为2.092 6 mg/g,RSD 为1.89%;马钱子碱平均含量为1.934 4 mg/g,RSD 为1.90%。
  2.8 加样回收率实验
  精取6 份已知含量的供试品,精加士的宁对照品和马钱子碱对照品,按上述供试品溶液制备和色谱条件测定含量。
  3 讨论
  根据士的宁和马钱子碱对照品的光谱扫描图,参照《中国药典》2010 年版一部马钱子项下的含量测定方法,确定260 nm 为测定波长。本实验考察了回流、超声提取方法,根据士的宁和马钱子碱的性质,选择氢氧化钠试液和三氯甲烷为溶剂,用氢氧化钠试液浸渍1 小时后加三氯甲烷超声提取30 分钟和用氢氧化钠试液浸渍30 分钟后加三氯甲烷回流提取2 小时,两种方法进行比较,结果士的宁和马钱子碱的含量相当,考虑操作方法的简便易行,确定提取方法为超声提取。参照《中国药典》2010 年版一部马钱子项下含量测定的方法,采用乙腈-0.01 mol/L 庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调节pH 值2.8)系统为本法的流动相,通过实验将二者比例调整为21∶79,在此条件下,供试品图谱基线稳定,分离效果好,主峰前后无杂峰,保留时间比较适中。马钱子为马钱科植物马钱的干燥成熟种子,又名番木鳖,其毒性成分主要是士的宁和马钱子碱,同时也是有效成分,其中士的宁的毒性较大,约为马钱子碱的20 倍,成人口服5~10 mg 就会有中毒现象,30 mg 即可致死亡。因此马钱子及其制剂应制订士的宁和马钱子碱的控制指标,以确保制剂的安全性和有效性。本实验采用HPLC 法测定十三味马钱子丸中士的宁与马钱子碱的含量,其样品制备方法简单,分析快速,精密度高,重现性较好,专属性强,可为十三味马钱子丸质量标准的提高提供参考。
 

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