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中医学----谈青翘正丁醇部位连翘苷、连翘酯苷A 的制备及抑菌、抗氧化活性

来源: 长沙中视澜庭教育咨询有限公司  日期:2018-02-25 08:56:57  点击:126 
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连翘为木犀科植物连翘的干燥果实,按其采收时期不同分为“青翘”和“老翘”。连翘传统用于治疗急性风热感冒、淋巴结结核、痈肿疮毒、尿路感染等症状,具有抗菌、抗氧化、镇吐等药理作用。目前,连翘为市售双黄连口服液及粉针剂、银翘解毒剂及VC 银翘片等中药制剂的主要原料。近年来,许多研究学者对连翘提取物的化学成分和生物活性进行了研究,结果表明连翘中主要含有苯乙醇及其苷类、C6-C2 天然醇类、木脂素类、五环三萜类及黄酮类,其中连翘苷、连翘酯苷、芦丁等为连翘的主要成分; 连翘提取物具有显著的抑菌活性、抗氧化活性、保肝作用、抗炎作用、解热镇痛及镇吐作用。前期有学者对连翘苷及连翘酯苷的生物活性进行了研究,文献结果显示连翘酯苷具有显著的抗氧化、抗微生物感染及清除自由基减轻过氧化损伤的作用; 连翘苷具有抗氧化作用、降血脂作用、抗炎解热及中和内毒素的作用。

  青翘是将连翘果实初熟尚带绿色时采收,并经过杀青处理后,晾干为青翘。国内外学者对青翘的研究相对较少,特别是对青翘中连翘苷及连翘酯苷等活性成分抑菌、抗氧化等方面的对比研究鲜有报道。本文以青翘为研究对象,制备其主要的活性成分青翘正丁醇部位的连翘苷、连翘酯苷A,并对两者抑菌活性及抗氧化活性进行了对比研究,为青翘的进一步研究提供依据。
  1 材料
  1. 1 菌株大肠埃希菌Escherichia coli,由山西医科大学第一附属医院提供,金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus,由山西生物应用职业技术学院微生物实验室提供,肺炎链球菌Streptococcuspneumoniae,由广东省微生物菌种保藏中心提供。
  1. 2 试剂与药材DPPH ( 美国Sigma 公司) ,抗坏血酸( 上海山浦化工有限公司) ,所有试剂均为分析纯,青翘于2008 年6 月购自山西省安泽县连翘GAP生产基地,植物标本由山西省药检所郭文菊研究员鉴定为木犀科植物属连翘Forsythia suspensa 初熟时的干燥果实; 连翘苷对照品( 中国药品生物制品检定所,纯度> 98%,批号110821-201112) ,连翘酯苷A 对照品( 山西大学张立伟老师科研组馈赠,纯度> 98%) 。
  1. 3 仪器Cary50 型紫外分光光度计( 美国瓦里安中国有限公司) ,LMQ-R-3260B 型高压蒸气灭菌器( 山东新华医疗器械股份有限公司) 。
  2 方法
  2. 1 连翘苷、连翘酯苷A 的制备取约20 g 青翘正丁醇部位总浸膏进行正相硅胶柱层析分离( 硅胶粒径为200 ~ 300 目) ,然后用三氯甲烷-甲醇系统( 80∶ 1,50∶ 1,30∶ 1,20∶ 1,10∶ 1,8∶ 1,5∶ 1) 进行梯度洗脱。
  2. 1. 1 连翘苷的制备取约20 g 青翘正丁醇部位总浸膏进行正相硅胶柱层析分离( 硅胶粒径为200 ~ 300目) ,然后用三氯甲烷-甲醇系统( 80∶ 1,50∶1,30∶ 1,20∶ 1,10∶ 1,8∶ 1,5∶ 1) 进行梯度洗脱,合并馏分20∶ 1,回收溶剂。然后再用三氯甲烷-甲醇系统反复硅胶柱层析( 硅胶为H 型柱层析硅胶) 及重结晶后得到白色粉末。该粉末易溶于甲醇,与连翘苷对照品共薄层( 三氯甲烷-甲醇10∶ 1) ,其点形、点的颜色及Rf 值相同,确定其为连翘苷。
  2. 1. 2 连翘酯苷A 的制备取约20 g 青翘正丁醇部位总浸膏进行正相硅胶柱层析分离( 硅胶粒径为200 ~ 300 目) ,然后用三氯甲烷-甲醇系统( 80 ∶ 1,50∶ 1,30∶ 1,20∶ 1,10∶ 1,8∶ 1,5∶ 1) 进行梯度洗脱,合并馏分5∶ 1,回收溶剂。然后再用三氯甲烷-甲醇系统反复硅胶柱层析( 硅胶为H 型柱层析硅胶) 及重结晶后得到白色粉末。该粉末易溶于甲醇,与连翘酯苷A 对照品共薄层( 乙酸乙酯-甲酸-水9∶ 1∶ 1) ,其点形、点的颜色及Rf 值相同,确定其为连翘酯苷A。
  2. 2 K-B 纸片法抑菌活性研究
  2. 2. 1 药敏纸片的制备用打孔机将普通定性滤纸打成若干直径为6 mm 的圆形纸片,放入压力蒸气灭菌器中,在121 ℃下,高压灭菌20 min,干燥。分别称取正丁醇部位总浸膏、分离得到的连翘苷、连翘酯苷A 样品各50 mg,用合适的溶剂溶解,定容于5 mL 量瓶中。无菌条件下用移液枪吸取药液,打在空白滤纸片上,使滤纸片完全干燥,使之成为含药量为5 mg 的药敏纸片,备用。
  2. 2. 2 固体培养基的制备用天平准确称取33 g营养琼脂,置于1 000 mL 锥形瓶中,加入蒸馏水1 000 mL,加热搅拌使之完全溶解。放入压力蒸气灭菌器中于121 ℃下高压灭菌20 min,取出,趁热倒入经过高压灭菌的培养皿中,厚度约为3 ~ 5 mm,冷却凝固后备用。
  2. 2. 3 样品体外抑菌活性测定将合适浓度的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌菌液分别接种到固体培养基表面,用无菌镊子夹取已经制备好的青翘正丁醇部位总浸膏药敏片、连翘苷药敏片及连翘酯苷A 药敏片,贴于培养基表面。以含药量10 μg的庆大霉素药敏片作为阳性对照,以溶剂空白药敏片作为阴性对照,在37 ℃下培养24 h,观察并测量抑菌圈直径。
  2. 3 DPPH 法测定清除DPPH 自由基的抗氧化能力
  2. 3. 1 样品的制备
  ①DPPH 溶液制备: 称取3. 9 mg DPPH 于100 mL 棕色量瓶中,用甲醇定容至刻度,超声30 min 使其充分溶解,摇匀,备用; ②抗坏血酸溶液制备: 称取抗坏血酸3. 0 mg,用甲醇溶解,置于10 mL 棕色量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,备用; ③样品溶液制备: 将正丁醇部位总浸膏、分离得到的连翘苷及连翘酯苷A 样品用甲醇配制成适当浓度的样品溶液,微孔滤膜过滤,备用。
  2. 3. 2 样品的测定取6 对比色皿,加样后避光反应30 min,在517 nm 处依次以相应对照组调零,测定样品组的吸光度( A) ,平行测定3 次,求其平均值,并计算样品对自由基的清除率( CR) ,CR =( ADPPH - A样品) /ADPPH × 100%。然后采用SPSS 13. 0软件求其半数清除浓度( IC50) ,取其平均值,并与抗坏血酸的IC50进行比较,评价样品清除DPPH 自由基的抗氧化能力。
  2. 4 统计方法采用SPSS 13. 0 软件系统对实验数据进行统计学分析,统计所得数据以珋x ± s 表示。
  3 结果
  3. 1 样品体外抑菌活性测定观察并测量抑菌圈直径,连翘酯苷A 的抑菌活性高于青翘正丁醇部位总浸膏的抑菌活性,低于庆大霉素的抑菌活性,而连翘苷无抑菌活性; 连翘酯苷A 对3 种细菌的抑制强弱为: 大肠埃希菌﹥金黄色葡萄球菌﹥肺炎链球菌。
  3. 3 正丁醇部位浸膏样本测定结果实验最终选择最合适的正丁醇部位浸膏样本质量浓度为0. 465 g·L - 1,清除DPPH 自由基的实验数据如表3,通过计算求得正丁醇部位浸膏样本IC50为( 6. 263 ±0. 016) mg·L - 1。
  3. 4 连翘酯苷A 样本测定结果实验最终选择最合适的样本质量浓度为0. 35 g·L -1,清除DPPH 自由基的实验数据如表4,通过计算,并用SPSS 13. 0 软件求得连翘酯苷A 样本IC50为( 4. 656 6 ±0. 001 6) mg·L -1。
  3. 5 连翘苷样本测定结果实验最终选择最合适的样本浓度为0. 465 g·L - 1,清除DPPH 自由基的实验数据如表5,通过计算,并用SPSS 13. 0 软件求得连翘苷样本IC50为( 881. 45 ± 1. 66) mg·L - 1。以抗坏血酸IC50为基准,计算各样本清除DPPH自由基的相对活性,各样本相对活性计算公式为: 相对活性= 抗坏血酸IC50 /样品IC50 × 100%。计算结果表明,正丁醇浸膏、连翘酯苷、连翘苷清除DPPH自由基的相对活性分别为63. 3%,85. 16%,0. 45%。
  4 讨论
  连翘为临床常用中药之一,有清热解毒,散结消肿之功效,传统用于痈疽,丹毒,风热感冒,高热烦渴,神昏发斑,热淋、尿闭等,有“疮家圣药”之称,目前连翘药材已成为清热解毒中药成方制剂的重要原料。连翘主要含有木脂素类、苯乙醇苷类、黄酮类、萜类等化学成分,其中连翘苷、连翘酯苷、芦丁等为连翘的主要特征成分。连翘按其采收时期的不同分为青翘和老翘,前期研究文献表明,青翘中主要化学成分含量高于老翘,对于连翘中抑菌的主要成分是连翘苷还是连翘酯苷仍然存在分歧。
  目前,从天然植物中寻找有效抗氧化成分并将其应用于医药、食品、保健品、饮料、化妆品等领域中,是当今研究的热点之一。现代生物学研究表明,许多疾病与自由基导致的生物大分子如蛋白质、脂质以及DNA 损伤有关,天然抗氧化剂如酚类化学成分对自由基有很强的清除作用。连翘中含有酚类的化学成分,因此将连翘开发为一种纯天然的预防和治疗由活性氧引起的衰老、心脑血管、高血脂等疾病的药物以及新型的天然食品抗氧化剂具有广泛的应用前景。
  到目前为止,《中国药典》一直采用连翘苷为指标成分对连翘进行质量评价。本实验结果显示,连翘苷A 对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及肺炎链球菌几乎没有抑制作用,而连翘酯苷A 对所选择的3种菌均有较强的抑制作用。连翘苷及连翘酯苷A为连翘的主要特征性成分,前期研究报告称连翘酯苷A 的含量高于连翘苷的含量,且连翘酯苷对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的抑制效果远远大于连翘苷,从清除DPPH 自由基的抗氧化能力实验结果可以看出: 连翘苷几乎没有清除DPPH 自由基的抗氧化能力,与之相比,连翘酯苷A有很强的清除DPPH 自由基的抗氧化能力。与阳性对照药抗坏血酸相比,连翘酯苷A 的抗氧化活性能力略低于抗坏血酸,相对活性为85. 16%。因此,笔者认为在评价连翘药材或是以抑菌、抗氧化活性为主要功效的连翘制剂质量时,以连翘酯苷A 为指标成分可能更为合理,值得深入研究和进一步确认。本文为青翘的质量控制及其所含有效成分连翘苷及连翘酯苷A 活性的进一步研究提供依据。

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